Ένα φίλτρο φθορισμού είναι ένα βασικό συστατικό στο μικροσκόπιο φθορισμού.Ένα τυπικό σύστημα έχει τρία βασικά φίλτρα: ένα φίλτρο διέγερσης, ένα φίλτρο εκπομπής και ένα διχρωμικό κάτοπτρο.Συνήθως συσκευάζονται σε κύβο έτσι ώστε η ομάδα να εισάγεται μαζί στο μικροσκόπιο.
Πώς λειτουργεί ένα φίλτρο φθορισμού;
Φίλτρο διέγερσης
Τα φίλτρα διέγερσης μεταδίδουν φως συγκεκριμένου μήκους κύματος και μπλοκάρουν άλλα μήκη κύματος.Μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή διαφορετικών χρωμάτων ρυθμίζοντας το φίλτρο ώστε να επιτρέπει μόνο ένα χρώμα να περάσει.Τα φίλτρα διέγερσης διατίθενται σε δύο κύριους τύπους - φίλτρα διέλευσης μακράς διάρκειας και φίλτρα διέλευσης ζώνης.Ο διεγέρτης είναι συνήθως ένα φίλτρο διέλευσης ζώνης που διέρχεται μόνο τα μήκη κύματος που απορροφούνται από το φθοροφόρο, ελαχιστοποιώντας έτσι τη διέγερση άλλων πηγών φθορισμού και εμποδίζοντας το φως διέγερσης στη ζώνη εκπομπής φθορισμού.Όπως φαίνεται από την μπλε γραμμή στο σχήμα, η BP είναι 460-495, που σημαίνει ότι μπορεί να περάσει μόνο μέσω του φθορισμού των 460-495nm.
Τοποθετείται εντός της διαδρομής φωτισμού ενός μικροσκοπίου φθορισμού και φιλτράρει όλα τα μήκη κύματος της φωτεινής πηγής εκτός από το εύρος διέγερσης φθοροφόρων.Η ελάχιστη μετάδοση φίλτρου υπαγορεύει τη φωτεινότητα και τη φωτεινότητα των εικόνων.Συνιστάται τουλάχιστον 40% μετάδοση για οποιοδήποτε φίλτρο διέγερσης έτσι ώστε η μετάδοση να είναι ιδανικά >85%.Το εύρος ζώνης του φίλτρου διέγερσης πρέπει να είναι εξ ολοκλήρου εντός του εύρους διέγερσης φθοροφόρου έτσι ώστε το κεντρικό μήκος κύματος (CWL) του φίλτρου να είναι όσο το δυνατόν πλησιέστερο στο μέγιστο μήκος κύματος διέγερσης του φθοροφόρου.Η οπτική πυκνότητα του φίλτρου διέγερσης (OD) υπαγορεύει το σκοτάδι της εικόνας φόντου.Το OD είναι ένα μέτρο του πόσο καλά ένα φίλτρο μπλοκάρει τα μήκη κύματος εκτός του εύρους μετάδοσης ή του εύρους ζώνης.Συνιστάται ελάχιστο OD 3,0, αλλά το OD 6,0 ή μεγαλύτερο είναι το ιδανικό.
Φίλτρο εκπομπών
Τα φίλτρα εκπομπής εξυπηρετούν το σκοπό να επιτρέπουν στον επιθυμητό φθορισμό από το δείγμα να φτάσει στον ανιχνευτή.Μπλοκάρουν μικρότερα μήκη κύματος και έχουν υψηλή μετάδοση για μεγαλύτερα μήκη κύματος.Ο τύπος του φίλτρου συνδέεται επίσης με έναν αριθμό, π.χ. BA510IF στο σχήμα (φίλτρο φραγμού παρεμβολών), ο προσδιορισμός αυτός αναφέρεται στο μήκος κύματος στο 50% της μέγιστης μετάδοσής του.
Οι ίδιες συστάσεις για τα φίλτρα διέγερσης ισχύουν για τα φίλτρα εκπομπής: ελάχιστη μετάδοση, εύρος ζώνης, OD και CWL.Ένα φίλτρο εκπομπών με τον ιδανικό συνδυασμό CWL, ελάχιστης μετάδοσης και OD παρέχει τις φωτεινότερες δυνατές εικόνες, με το βαθύτερο δυνατό μπλοκάρισμα και διασφαλίζει την ανίχνευση των πιο αδύναμων σημάτων εκπομπής.
Διχρωικός καθρέφτης
Το διχρωμικό κάτοπτρο τοποθετείται μεταξύ του φίλτρου διέγερσης και του φίλτρου εκπομπής σε γωνία 45° και αντανακλά το σήμα διέγερσης προς το φθοροφόρο ενώ μεταδίδει το σήμα εκπομπής προς τον ανιχνευτή.Τα ιδανικά διχρωικά φίλτρα και διαχωριστές δέσμης έχουν απότομες μεταβάσεις μεταξύ μέγιστης ανάκλασης και μέγιστης μετάδοσης, με ανάκλαση >95% για το εύρος ζώνης του φίλτρου διέγερσης και μετάδοση >90% για το εύρος ζώνης του φίλτρου εκπομπής.Επιλέξτε το φίλτρο έχοντας υπόψη το μήκος κύματος τομής (λ) του φθοροφόρου, για να ελαχιστοποιήσετε το αδέσποτο φως και να μεγιστοποιήσετε την αναλογία σήματος προς θόρυβο της φθορίζουσας εικόνας.
Το διχρωμικό κάτοπτρο σε αυτό το σχήμα είναι το DM505, που ονομάζεται έτσι επειδή τα 505 νανόμετρα είναι το μήκος κύματος στο 50% της μέγιστης μετάδοσης για αυτόν τον καθρέφτη.Η καμπύλη μετάδοσης για αυτό το κάτοπτρο δείχνει υψηλή μετάδοση πάνω από 505 nm, απότομη πτώση στη μετάδοση στα αριστερά των 505 νανόμετρα και μέγιστη ανακλαστικότητα στα αριστερά των 505 νανόμετρα, αλλά μπορεί να έχει κάποια μετάδοση κάτω από 505 nm.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ των φίλτρων μακράς διέλευσης και ζώνης διέλευσης;
Τα φίλτρα φθορισμού μπορούν να χωριστούν σε δύο τύπους: long pass (LP) και band pass (BP).
Τα μακροπερατά φίλτρα εκπέμπουν μεγάλα μήκη κύματος και μπλοκάρουν τα μικρότερα.Το μήκος κύματος αποκοπής είναι η τιμή στο 50% της μετάδοσης αιχμής και όλα τα μήκη κύματος πάνω από την αποκοπή μεταδίδονται από τα μακροπερατά φίλτρα.Χρησιμοποιούνται συχνά σε διχρωμικούς καθρέφτες και φίλτρα εκπομπής ρύπων.Τα μακροπερατά φίλτρα θα πρέπει να χρησιμοποιούνται όταν η εφαρμογή απαιτεί συλλογή μέγιστης εκπομπής και όταν η φασματική διάκριση δεν είναι επιθυμητή ή απαραίτητη, κάτι που συμβαίνει γενικά για ανιχνευτές που δημιουργούν ένα μεμονωμένο είδος εκπομπής σε δείγματα με σχετικά χαμηλά επίπεδα αυτοφθορισμού υποβάθρου.
Τα φίλτρα διέλευσης ζώνης εκπέμπουν μόνο μια συγκεκριμένη ζώνη μήκους κύματος και μπλοκάρουν άλλες.Μειώνουν την αλληλεπίδραση επιτρέποντας τη μετάδοση μόνο του ισχυρότερου τμήματος του φάσματος εκπομπής φθοροφόρου, μειώνουν τον θόρυβο αυτοφθορισμού και έτσι βελτιώνουν την αναλογία σήματος προς θόρυβο σε δείγματα αυτοφθορισμού υψηλού φόντου, που δεν μπορούν να προσφέρουν τα μακροπερατά φίλτρα.
Πόσους τύπους σετ φίλτρων φθορισμού μπορεί να παρέχει η BestScope;
Μερικοί συνήθεις τύποι φίλτρων περιλαμβάνουν μπλε, πράσινα και υπεριώδη φίλτρα.Όπως φαίνεται στον πίνακα.
| Σετ φίλτρων | Φίλτρο διέγερσης | Διχρωικός καθρέφτης | Φίλτρο φραγμού | Λάμπα LED Μήκος κύματος | Εφαρμογή |
| B | ΒΡ460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Μέθοδος αντισωμάτων φθορισμού ·Acidine orange: DNA, RNA ·Αυραμίνη: Φυματιώδης βάκιλος ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | ΒΡ510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Ροδαμίνη, TRITC: Μέθοδος αντισωμάτων φθορισμού ·Ιωδιούχο προπίδιο: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | · Παρατήρηση αυτοφθορισμού ·DAPI: χρώση DNA ·Hoechest 332528, 33342: χρησιμοποιείται για χρώση χρωμοσωμάτων |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Κατεχολαμίνες ·5-υδροξυ τρυπταμίνη ·Τετρακυκλίνη: Σκελετός, Δόντια |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Τα σετ φίλτρων που χρησιμοποιούνται σε αποκτήσεις φθορισμού σχεδιάζονται γύρω από τα κύρια μήκη κύματος που χρησιμοποιούνται σε εφαρμογές φθορισμού, τα οποία βασίζονται στα πιο χρησιμοποιούμενα φθοροφόρα.Για το λόγο αυτό, ονομάζονται επίσης από το φθοροφόρο που προορίζονται για απεικόνιση, όπως οι κύβοι φίλτρου DAPI (μπλε), FITC (πράσινοι) ή TRITC (κόκκινοι).
| Σετ φίλτρων | Φίλτρο διέγερσης | Διχρωικός καθρέφτης | Φίλτρο φραγμού | Λάμπα LED Μήκος κύματος |
| FITC | ΒΡ460-495 | DM505 | ΒΑ510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | ΒΑ435-485 | 365 nm |
| TRITC | ΒΡ528-553 | DM565 | ΒΑ578-633 | 535 nm |
| FL-Αυραμίνη | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Κόκκινο του Τέξας | ΒΡ540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | ΒΡ542-582 | DM593 | ΒΑ605-675 | 560 nm |
Πώς επιλέγετε ένα φίλτρο φθορισμού;
1. Η αρχή της επιλογής του φίλτρου φθορισμού είναι να αφήσετε το φως φθορισμού/εκπομπής να περάσει από το άκρο της απεικόνισης όσο το δυνατόν περισσότερο και να μπλοκάρει πλήρως το φως διέγερσης ταυτόχρονα, έτσι ώστε να επιτευχθεί η υψηλότερη αναλογία σήματος προς θόρυβο.Ειδικά για την εφαρμογή διέγερσης πολλαπλών φωτονίων και μικροσκοπίου ολικής εσωτερικής ανάκλασης, ο ασθενής θόρυβος θα προκαλέσει επίσης μεγάλη παρεμβολή στο αποτέλεσμα απεικόνισης, επομένως η απαίτηση για αναλογία σήματος προς θόρυβο είναι υψηλότερη.
2. Γνωρίστε το φάσμα διέγερσης και εκπομπής του φθοροφόρου.Για να κατασκευαστεί ένα σετ φίλτρων φθορισμού που δημιουργεί μια εικόνα υψηλής ποιότητας, υψηλής αντίθεσης με μαύρο φόντο, τα φίλτρα διέγερσης και εκπομπής θα πρέπει να επιτυγχάνουν υψηλή μετάδοση με ελάχιστο κυματισμό ζώνης διέλευσης στις περιοχές που αντιστοιχούν στις κορυφές διέγερσης ή τις εκπομπές φθοροφόρου.
3. Λάβετε υπόψη την ανθεκτικότητα των φίλτρων φθορισμού.Αυτά τα φίλτρα πρέπει να είναι αδιαπέραστα από πηγές έντονου φωτός που παράγουν υπεριώδες φως (UV) που θα μπορούσε να οδηγήσει σε «καύση», ιδιαίτερα του φίλτρου διεγέρτη καθώς υπόκειται στην πλήρη ένταση της πηγής φωτισμού.
Διαφορετικές εικόνες δειγμάτων φθορισμού
Οι πόροι συλλέγονται και οργανώνονται στο Διαδίκτυο και χρησιμοποιούνται μόνο για μάθηση και επικοινωνία.Εάν υπάρχει οποιαδήποτε παράβαση, επικοινωνήστε μαζί μας για διαγραφή.
Ώρα δημοσίευσης: Δεκ-09-2022